A cicatrização de feridas é um processo fisiológico complexo que envolve uma série de etapas interligadas e coordenadas para restaurar a integridade estrutural e funcional dos tecidos após lesão ou trauma. Os mecanismos fisiológicos de cura podem ser divididos em quatro fases principais: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação. 

Os produtos para a saúde podem apresentar eficácia cicatrizante, contribuindo para a proliferação celular e regeneração tecidual. Neste artigo abordaremos os princípios fisiológicos desse processo e as metodologias moleculares para validação da eficácia curativa.

Estágios fisiológicos da cura:

1. Fase de hemostasia:

A hemostasia é a primeira fase da cicatrização de feridas. É o processo que interrompe o sangramento e inicia a formação de um coágulo. Durante a hemostasia, ocorrem três etapas:

1. Vasoconstrição : Os vasos sanguíneos na área lesionada se contraem, reduzindo o fluxo sanguíneo. Isso ajuda a diminuir a perda de sangue.
2. Formação de coágulos: As plaquetas sanguíneas começam a se acumular no local da ferida, formando uma massa sólida. As plaquetas liberam substâncias químicas que ativam outras plaquetas, tornando o coágulo maior e mais sólido. As proteínas de coagulação do sangue também são ativadas e ajudam a estabilizar o coágulo.
3. Encolhimento do coágulo: O coágulo começa a se contrair, reduzindo o tamanho da ferida. Isso ajuda a limitar a perda de sangue e abre caminho para a próxima fase de cura.

Após a hemostasia, inicia-se a fase inflamatória, que envolve a chegada de células imunológicas e fatores de crescimento que auxiliam na reparação do tecido lesionado.

2. Fase inflamatória:

A fase inflamatória da cicatrização de feridas é caracterizada por uma resposta inflamatória aguda que ocorre imediatamente após a lesão. O objetivo desta fase é remover tecidos danificados e iniciar a reparação tecidual. A inflamação é mediada por células imunes, incluindo leucócitos, macrófagos e células dendríticas, que são atraídas para o local da lesão. Essas células ajudam a remover restos celulares, bactérias e outras substâncias estranhas, iniciando assim o processo de limpeza da ferida.

3. Fase proliferativa:

Nesta fase, as células começam a proliferar e sintetizar novo tecido para substituir o tecido danificado. Os fibroblastos são as células-chave nesta fase e são responsáveis ​​pela síntese de colágeno e outras proteínas da matriz extracelular, bem como pela formação de novos vasos sanguíneos. A angiogênese é um processo importante nesta fase, que envolve a formação de novos vasos sanguíneos para fornecer nutrientes e oxigênio às células em crescimento. A fase proliferativa pode durar várias semanas ou meses, dependendo da extensão da lesão e da capacidade do organismo de regenerar o tecido danificado.

4. Fase de remodelação:

Nesta fase final, o tecido cicatricial começa a remodelar e fortalecer. Os fibroblastos continuam a sintetizar colágeno e outras proteínas da matriz extracelular, mas a concentração dessas proteínas começa a diminuir e a organização da matriz começa a se tornar mais estruturada. O tecido cicatricial começa a se contrair e adquirir características mecânicas semelhantes às do tecido original. A fase de maturação pode durar de vários meses a anos, dependendo da gravidade da lesão e da localização do tecido cicatricial.

Metodologias de validação

Existem diversas metodologias para validação da eficácia cicatrizante de produtos para a saúde, que avaliam a proliferação, viabilidade e migração celular. Indicadores importantes da eficácia do produto na promoção da capacidade de reparação dos tecidos lesionados. A seguir discutiremos mais detalhes sobre algumas das técnicas in vitro mais utilizadas: scratch test, MTT, BrdU e NRU.

Cicatrização de feridas (teste de raspagem):

O ensaio Scratch, também conhecido como ensaio de raspagem ou ensaio de feridas, é uma técnica amplamente utilizada para avaliar a migração celular e a capacidade de fechar feridas in vitro. Neste ensaio, uma ferida é criada em uma monocamada de células cultivadas em uma placa de cultura, geralmente usando uma ferramenta romba, como uma pipeta ou ponta de seringa.

A progressão da cicatrização é observada observando o fechamento da ferida ao longo do tempo. As células da borda da ferida começam a se mover em direção ao centro da ferida, preenchendo o espaço vazio deixado pela raspagem. A velocidade e a eficiência desse processo de cura podem ser quantificadas por meio de técnicas de análise de imagens.

O estabelecimento de controles adequados é importante para validar a cura através do ensaio Scratch. Por exemplo, um grupo de células não tratadas pode ser utilizado como controlo negativo, enquanto um grupo de células tratadas com um agente que aumenta a migração celular pode ser utilizado como controlo positivo. Além disso, é importante repetir o experimento várias vezes para garantir que os resultados sejam consistentes.

Em resumo, o ensaio Scratch é uma técnica útil e amplamente utilizada para avaliar a migração celular e a capacidade de fechamento de feridas in vitro. A validação adequada desta técnica envolve a inclusão de controles apropriados e a replicação do experimento várias vezes para garantir a consistência dos resultados.

Citotoxicidade e proliferação celular (MTT, BrdU, NRU)

As técnicas MTT, BrdU e NRU são comumente utilizadas em estudos de citotoxicidade e proliferação celular para avaliar a eficácia cicatrizante de substâncias ou materiais.

• Ensaio MTT

A técnica MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) avalia a viabilidade celular e a atividade mitocondrial e baseia-se na conversão do sal de tetrazólio em formazano solúvel em água pelas células vivas. A quantidade de formazan produzida é proporcional à viabilidade celular e pode ser quantificada espectrofotometricamente.

A técnica MTT não avalia diretamente os mecanismos fisiológicos de cicatrização, mas sim a viabilidade celular e a atividade mitocondrial em cultura celular, que são indicadores indiretos da eficácia cicatrizante de uma substância ou material.

A viabilidade celular é importante na cura, pois são necessárias células vivas para substituir o tecido lesionado. A atividade mitocondrial é importante porque as mitocôndrias são responsáveis ​​pela produção da energia necessária às células para reparar tecidos lesionados.

Assim, a técnica MTT pode ser utilizada para avaliar a eficácia de uma substância ou material na preservação da viabilidade celular e da atividade mitocondrial em células envolvidas na cicatrização de feridas. Além disso, pode ser utilizado para avaliar o potencial citotóxico de um composto, o que pode prejudicar a cicatrização e levar a complicações no processo de cicatrização.

Portanto, embora a técnica MTT não avalie diretamente os mecanismos fisiológicos de cura, ela pode fornecer informações úteis sobre os efeitos curativos de uma substância ou material. Outras técnicas, como análise histológica e perfil de expressão genética, podem ser utilizadas em conjunto para avaliar diretamente os mecanismos fisiológicos de cicatrização de feridas.

• BrdU

A técnica BrdU (bromodeoxiuridina) é utilizada em estudos de proliferação celular e pode ser aplicada para validar a eficácia cicatrizante. BrdU é um análogo da timidina incorporado no DNA replicante de células em proliferação, permitindo assim a identificação de células que sofreram divisão celular.

Na avaliação da eficácia cicatrizante, a técnica BrdU pode ser utilizada para avaliar a taxa de proliferação celular na área da ferida. A aplicação do BrdU é feita em conjunto com um marcador fluorescente específico para BrdU, permitindo assim a identificação de células que sofreram divisão celular.

• NRU

A técnica NRU (Neutral Red Uptake) é utilizada na validação da eficácia cicatrizante através da avaliação da viabilidade celular. Esta técnica baseia-se na capacidade da célula em absorver o corante Vermelho Neutro, que se acumula nos seus lisossomas, e que, ao entrar em contacto com soluções ácidas, como a dos lisossomas, muda de cor, tornando-se vermelho.

Na técnica NRU, as células viáveis ​​da área da ferida são tratadas com o corante Vermelho Neutro e, posteriormente, com uma solução ácida, que provoca a liberação do corante dos lisossomos. O corante liberado é então quantificado por espectrofotometria e a absorvância medida é diretamente proporcional ao número de células viáveis ​​presentes.

A técnica NRU é uma forma simples e rápida de avaliar a viabilidade celular, mas é importante ressaltar que a técnica NRU não permite a diferenciação entre células específicas, como células inflamatórias e células epiteliais, e não fornece informações sobre a capacidade de proliferação celular, que é uma medida importante na cicatrização de feridas. Portanto, deve ser utilizado em conjunto com outras técnicas para uma avaliação mais completa da eficácia curativa.

A combinação dessas técnicas pode fornecer informações valiosas sobre citotoxicidade e proliferação celular em estudos de eficácia cicatrizante, permitindo avaliar tanto a viabilidade quanto a atividade celular na presença de produtos cicatrizantes, e validar sua eficácia.

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