No entanto, como muitos desses produtos são derivados de linhagens celulares humanas ou animais, é fundamental realizar avaliações rigorosas de segurança para mitigar os riscos potenciais de contaminação viral.

Com o intuito de abordar tais preocupações, o Conselho Internacional para Harmonização de Requisitos Técnicos para Produtos Farmacêuticos de Uso Humano (ICH) desenvolveu a diretriz Q5A(R2), que estabelece princípios para avaliar a segurança viral de produtos biotecnológicos originados de linhagens celulares de origem humana ou animal.

Antecedentes e Propósito

A diretriz ICH Q5A(R2) foi elaborada em colaboração entre as autoridades regulatórias e a indústria farmacêutica com o objetivo de fornecer uma estrutura unificada para avaliar a segurança viral de produtos biotecnológicos.

O principal propósito dessa diretriz é assegurar a segurança e qualidade dos produtos, ao abordar possíveis riscos de contaminação viral durante todas as etapas de desenvolvimento, produção e uso clínico.

Escopo da Diretriz ICH Q5A(R2)

A diretriz ICH Q5A(R2) é aplicável a produtos biotecnológicos derivados de linhagens celulares de origem humana ou animal.

Esta abrangência engloba diversos produtos, como vacinas, terapias gênicas, terapias celulares, produtos de diagnóstico e proteínas recombinantes, entre outros.

Princípios Fundamentais da Avaliação de Segurança Viral

A diretriz apresenta uma abordagem abrangente para a avaliação de segurança viral, compreendendo os seguintes aspectos:

1. Análise da Linhagem Celular: É essencial realizar uma caracterização detalhada da linhagem celular utilizada na produção do produto. Isso inclui identificação e documentação das origens celulares, histórico de manipulação genética, potenciais retrovírus endógenos e histórico de segurança.
2. Detecção de Vírus Conhecidos: Testes rigorosos devem ser conduzidos para detectar a presença de vírus conhecidos que possam contaminar o produto. São empregados métodos altamente sensíveis, como técnicas de biologia molecular.
3. Avaliação de Risco Viral: Uma avaliação abrangente de risco viral é realizada, levando em consideração a origem da linhagem celular, o potencial de contaminação viral, os processos de produção e a finalidade do produto. Isso ajuda a identificar e mitigar possíveis fontes de contaminação viral.
4. Estratégias de Redução de Risco: Com base na avaliação de risco viral, são implementadas estratégias adequadas para reduzir ou eliminar o risco de contaminação viral. Isso pode incluir etapas adicionais de purificação, inativação viral ou outros métodos de segurança.

Justificativa e Plano de Ação para Estudos de Inativação Viral e Testes de Vírus em Produtos Purificados

É de extrema importância desenvolver um protocolo relevante e racional para os estudos de inativação viral, abrangendo desde o nível de MCB (Master Cell Bank) até as várias etapas da produção do medicamento, incluindo a avaliação e caracterização do clearance viral no bulk não processado.

A avaliação e caracterização do clearance viral desempenham um papel crítico nesse processo, visando garantir que o produto final esteja livre de contaminação viral.

Ao selecionar vírus para estudos de clearance, é importante distinguir entre a necessidade de avaliar a capacidade do processo em eliminar vírus conhecidos e a intenção de estimar a robustez do processo por meio da caracterização do clearance de vírus “modelo” não específicos (descritos posteriormente).

O glossário fornece definições de vírus “relevantes”, específicos e “modelos” não específicos.

A avaliação do processo requer o conhecimento da quantidade de vírus que pode estar presente no processo, como no bulk não processado, e da quantidade que pode ser eliminada para garantir a segurança do produto.

A compreensão da inativação ao longo do tempo é útil para assegurar a eficácia do processo de inativação.

Quando se avalia o clearance de contaminantes conhecidos, serão necessários estudos detalhados de inativação ao longo do tempo, demonstração da reprodutibilidade da inativação/remoção e avaliação dos parâmetros do processo.

Quando um processo de fabricação é caracterizado quanto à robustez do clearance usando vírus “modelo” não específicos, deve-se dedicar atenção especial aos vírus não envelopados no desenho do estudo.

A extensão dos estudos de caracterização do clearance viral pode ser influenciada pelos resultados dos testes em linhagens celulares e no bulk não processado. Esses estudos devem ser realizados conforme descrito a seguir (seção 6).

A tabela 4 apresentada a diante ilustra um exemplo de plano de ação, abrangendo a avaliação do processo e caracterização do clearance viral, bem como os testes de vírus no bulk purificado, em resposta aos resultados dos testes de vírus nas células e/ou no bulk não processado.

Diversos cenários são contemplados. Em todos os casos, é necessário realizar a caracterização do clearance usando vírus “modelo” não específicos. As situações mais comuns são os Casos A e B. Normalmente, sistemas de produção contaminados com um vírus diferente de um retrovírus de roedor não são utilizados.

Quando existirem razões convincentes e bem justificadas para a produção de medicamentos usando uma linhagem celular dos Casos C, D ou E, isso deve ser discutido com as autoridades regulatórias. Para os Casos C, D e E, é fundamental possuir etapas eficazes validadas para inativar/remover o vírus em questão do processo de fabricação.

Caso A: Quando nenhum vírus, partícula viral ou partícula viral retroviral foi demonstrado nas células ou no bulk não processado, estudos de remoção e inativação viral devem ser realizados com vírus “modelo” não específicos, conforme mencionado anteriormente.

Caso B: Quando apenas um retrovírus de roedor (ou uma partícula viral retroviral que se acredita ser não patogênica, como as partículas dos tipos A e R de roedor) está presente, a avaliação do processo deve ser realizada usando um vírus “modelo” específico, como um vírus da leucemia murina.

O bulk purificado deve ser testado usando métodos adequados, com alta especificidade e sensibilidade para a detecção do vírus em questão. Para a autorização de comercialização, dados de pelo menos 3 lotes de bulk purificado em escala de planta piloto ou comercial devem ser fornecidos.

Linhagens celulares como CHO, C127, BHK e linhagens híbridas de murinos têm sido frequentemente utilizadas como substratos para a produção de medicamentos, sem relatos de problemas de segurança relacionados à contaminação viral dos produtos.

Para essas linhagens celulares, em que as partículas endógenas foram extensivamente caracterizadas e o clearance foi demonstrado, normalmente não é necessário testar a presença das partículas não infecciosas no bulk purificado. Estudos com vírus “modelo” não específicos, como no Caso A, são apropriados.

Caso C: Quando se sabe que as células ou o bulk não processado contêm um vírus diferente de um retrovírus de roedor, para o qual não há evidências de capacidade de infectar seres humanos (como aqueles identificados na nota de rodapé 2 da Tabela 3, exceto retrovírus de roedores Não Caso B), os estudos de avaliação de remoção e inativação devem usar o vírus identificado.

Se não for possível usar o vírus identificado, devem ser usados vírus “modelos” “relevantes” ou específicos para demonstrar o clearance aceitável. Dados de inativação dependente do tempo para vírus identificados (ou vírus “modelos” “relevantes” ou específicos) na etapa crítica de inativação devem ser obtidos como parte da avaliação do processo para esses vírus.

O bulk purificado deve ser testado usando métodos adequados, com alta especificidade e sensibilidade para a detecção do vírus em questão.

Para a autorização de comercialização, dados de pelo menos 3 lotes de bulk purificado fabricados em escala de planta piloto ou comercial devem ser fornecidos.

Caso D: Quando um patógeno humano conhecido, como os indicados na nota de rodapé 1 da Tabela 3, é identificado, o produto pode ser considerado aceitável apenas sob circunstâncias excepcionais.

Nesse caso, é recomendado que o vírus identificado seja usado para os estudos de avaliação de remoção e inativação, e sejam empregados métodos específicos com alta especificidade e sensibilidade para a detecção do vírus em questão.

Se não for possível usar o vírus identificado, devem ser usados vírus “modelos” “relevantes” e/ou específicos (descritos posteriormente).

O processo deve mostrar que consegue remover e inativar os vírus selecionados durante os processos de purificação e inativação.

Dados de inativação dependentes do tempo para a etapa crítica de inativação devem ser obtidos como parte da avaliação do processo.

O bulk purificado deve ser testado usando métodos adequados, com alta especificidade e sensibilidade para a detecção do vírus em questão.

Para a autorização de comercialização, dados de pelo menos 3 lotes de bulk purificado fabricados em escala de planta piloto ou comercial devem ser fornecidos.

Caso E: Quando um vírus, que não pode ser classificado por metodologias atualmente disponíveis, é detectado nas células ou no bulk não processado, o produto é geralmente considerado inaceitável, pois o vírus pode ser patogênico.

No caso muito raro em que existam razões convincentes e bem justificadas para a produção de medicamentos usando tal linhagem celular, isso deve ser discutido com as autoridades regulatórias antes de prosseguir.

Em conclusão, a diretriz ICH Q5A(R2) representa um marco essencial para garantir a segurança viral em produtos biotecnológicos derivados de linhagens celulares de origem humana ou animal. Através dessa diretriz, é possível estabelecer uma abordagem unificada e criteriosa para a avaliação e mitigação de riscos de contaminação viral, assegurando que esses produtos sejam seguros para uso clínico.

A avaliação de segurança viral começa com uma análise detalhada da linhagem celular, identificando quaisquer potenciais riscos de contaminação viral. Em seguida, são realizados testes rigorosos para detectar a presença de vírus conhecidos e outras partículas virais. Com base nessa avaliação de risco, são implementadas estratégias adequadas para reduzir ou eliminar qualquer contaminação viral identificada, incluindo etapas adicionais de purificação e inativação viral.

Um dos pontos chave do plano de ação é a caracterização do clearance viral durante o processo de produção do medicamento, desde o nível de MCB até o bulk purificado. É fundamental selecionar vírus “modelo” não específicos e, em alguns casos, vírus “modelo” específicos para avaliar a capacidade de inativação e remoção dos contaminantes virais conhecidos. Além disso, para casos em que um vírus conhecido é detectado nas células ou bulk não processado, estudos específicos devem ser conduzidos para demonstrar a eficácia da remoção e inativação durante o processo de fabricação.

É importante ressaltar que a diretriz ICH Q5A(R2) deve ser seguida de forma criteriosa para garantir a segurança dos produtos biotecnológicos. Os fabricantes devem colaborar com as autoridades regulatórias em todas as etapas do processo, fornecendo dados confiáveis e relevantes para a avaliação da segurança viral.

Com a implementação efetiva dessa diretriz, os produtos biotecnológicos derivados de linhagens celulares de origem humana ou animal podem ser desenvolvidos e produzidos com maior confiança, oferecendo tratamentos inovadores e seguros para pacientes em todo o mundo. A busca contínua pela excelência na avaliação de segurança viral é essencial para aprimorar continuamente os padrões de qualidade e segurança dos produtos biotecnológicos, impulsionando avanços significativos na medicina e melhorando a vida das pessoas.

Tabela 4 – Plano de ação para inativação viral 

1. Resultados dos testes de vírus para o substrato celular e/ou no nível do bulk não processado. Culturas celulares utilizadas para a produção que estão contaminadas com vírus geralmente não são aceitáveis. Vírus endógenos (como retrovírus) ou vírus que fazem parte integrante do MCB podem ser aceitáveis se forem seguidos procedimentos apropriados de avaliação de remoção viral.

2.O uso de material de origem contaminada com vírus, seja ou não conhecido por ser infeccioso e/ou patogênico em humanos, só será permitido em circunstâncias muito excepcionais.

3. Vírus foram observados por métodos diretos ou indiretos.

4. Acredita-se que sejam não patogênicos.

5. Devem-se realizar a caracterização do clearance usando vírus “modelo” não específicos.

6. A avaliação do processo para vírus “relevantes” ou vírus “modelo” específicos deve ser realizada.

7. Ver texto sobre o Caso E.

8. A ausência de vírus detectáveis deve ser confirmada no bulk purificado por meio de métodos adequados, com alta especificidade e sensibilidade para a detecção do vírus em questão. Para a obtenção da autorização de comercialização, dados de pelo menos 3 lotes de bulk purificado fabricados em escala de planta piloto ou comercial devem ser fornecidos. Entretanto, para linhagens celulares como células CHO, cujas partículas endógenas foram extensivamente caracterizadas e o clearance adequado foi demonstrado, geralmente não é necessário testar a presença das partículas não infecciosas no bulk purificado.

Sobre a Crop

A Crop é uma empresa prestadora de serviços de pesquisa de nova geração para o desenvolvimento de ingredientes e produtos em saúde. Especializada em metodologias moleculares e celulares, a Crop oferece testes que minimizam o humano e oferecem dados mecanísticos precisos para validação de segurança e eficácia.

Nossos serviços estão disponíveis para empresas privadas, instituições acadêmicas e centros de pesquisa governamentais, desde a descoberta até a fase pré-clínica, da triagem à validação.

Saiba mais sobre a Crop Labs e entre em contato. Vamos trabalhar juntos: https://crop-labs.com

Este artigo tem como objetivo fornecer uma exploração abrangente dos mecanismos fisiológicos que regem o crescimento do cabelo, bem como dos mecanismos de ação e métodos de validação utilizados para avaliar a eficácia dos ingredientes cosméticos neste sentido.

Mecanismos fisiológicos de crescimento capilar

Aqui estão alguns dos principais mecanismos envolvidos no crescimento do cabelo:

Ciclo capilar 

O cabelo passa por um ciclo de crescimento que consiste em três fases principais: anágena (fase de crescimento ativo), catágena (fase de transição) e telógena (fase de repouso). Durante a fase anágena, as células da matriz capilar na raiz do cabelo se dividem rapidamente, resultando no crescimento do cabelo. A duração desta fase determina o comprimento máximo do cabelo. Após a fase anágena, o cabelo entra na fase catágena, onde o crescimento cessa e a papila dérmica se contrai. Finalmente, o cabelo entra na fase telógena, onde repousa antes de cair e ser substituído por cabelo novo e em crescimento.

Papila dérmica

A papila dérmica é uma estrutura localizada na base do folículo piloso. Desempenha um papel crucial no crescimento do cabelo, fornecendo nutrientes e oxigênio às células da matriz capilar. A papila dérmica contém vasos sanguíneos que transportam nutrientes e hormônios essenciais para o crescimento do cabelo. Além disso, ela também é responsável por liberar fatores de crescimento que estimulam a atividade das células da matriz capilar.

Células da Matriz Capilar

As células da matriz capilar são células-tronco localizadas na raiz do cabelo, logo acima da papila dérmica. Essas células têm a capacidade de se dividir e se diferenciar em células ciliadas especializadas. Durante a fase anágena do ciclo capilar, as células da matriz capilar se multiplicam e empurram as células mais velhas em direção à superfície do couro cabeludo, resultando no crescimento do cabelo.

Vascularização 

A vascularização adequada é essencial para o crescimento do cabelo. Os vasos sanguíneos fornecem nutrientes, oxigênio e hormônios às células da matriz capilar e da papila dérmica. Além disso, a vascularização também ajuda a remover resíduos metabólicos das células ciliadas, mantendo um ambiente saudável para o crescimento do cabelo.

Hormônios 

Vários hormônios desempenham um papel importante no crescimento do cabelo. Por exemplo, a testosterona e seus derivados, como a diidrotestosterona (DHT), têm efeitos significativos no crescimento do cabelo. Em algumas pessoas, a sensibilidade dos folículos capilares ao DHT pode levar à miniaturização dos folículos, resultando na queda gradual do cabelo.

Fatores de crescimento

Vários fatores de crescimento, como o fator de crescimento de fibroblastos (FGF), o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), desempenham um papel importante no crescimento do cabelo. Esses fatores de crescimento estimulam a proliferação e diferenciação das células ciliadas, promovendo o crescimento capilar.

Mecanismos de ação de ingredientes cosméticos

Os ingredientes cosméticos podem atuar de diferentes maneiras no couro cabeludo e nos folículos capilares para estimular o crescimento capilar, por exemplo, estimulando a circulação sanguínea e o ciclo de crescimento capilar, inibindo a enzima 5-alfa-redutase, nutrindo e fortalecendo os folículos capilares, reduzindo a inflamação do couro cabeludo. , estimulando a angiogênese, a atividade da proteína B-catenina e a incorporação e proliferação celular. Neste artigo, vamos nos concentrar nos três últimos.

Angiogênese em HHDPCs (células da papila dérmica do cabelo humano): 

A angiogênese refere-se à formação de novos vasos sanguíneos, que é essencial para fornecer nutrientes e oxigênio aos folículos capilares. Alguns ingredientes cosméticos podem promover a angiogênese no couro cabeludo, estimulando o crescimento de novos vasos sanguíneos. Por exemplo, o extrato de ginseng e a niacinamida são conhecidos pelas suas propriedades vasodilatadoras, que podem aumentar o fluxo sanguíneo para o couro cabeludo e promover a angiogênese.

Proteína B-catenina: 

A proteína B-catenina desempenha um papel importante na regulação do ciclo capilar e na sinalização celular. Ingredientes cosméticos que estimulam a atividade da proteína B-catenina podem promover o crescimento do cabelo. Por exemplo, sabe-se que alguns extratos de plantas, como Polygonum multiflorum (fo-ti) e Centella asiatica, aumentam os níveis de B-catenina, o que pode estimular a proliferação de células na papila dérmica e nos folículos capilares.

Incorporação e proliferação celular: 

A incorporação e proliferação celular são processos fundamentais para o crescimento capilar. Os ingredientes cosméticos podem estimular a atividade mitótica e a proliferação das células do folículo capilar, promovendo o crescimento do cabelo. Alguns ingredientes, como o minoxidil, têm a capacidade de prolongar a fase anágena do ciclo capilar, o que significa que mais folículos capilares estão crescendo ativamente. Além disso, certos extratos de plantas, como o extrato de urtiga e o óleo de jojoba, podem fornecer nutrientes e estimular a proliferação celular nos folículos capilares.

Metodologias de validação de eficácia

Para validar a eficácia dos ingredientes cosméticos na estimulação do crescimento capilar, diversas metodologias e técnicas in vitro podem ser utilizadas. Aqui estão alguns dos principais:

Ensaios de proliferação celular: 

Esses ensaios avaliam a capacidade do ingrediente cosmético em estimular a proliferação de células do folículo capilar. Ensaios colorimétricos, como o ensaio MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), ou ensaios de incorporação de nucleosídeos marcados, como o ensaio BrdU (5-bromo-2′- desoxiuridina).

Ensaios de migração celular: 

Estes ensaios avaliam a capacidade do ingrediente cosmético em estimular a migração de células endoteliais ou células da papila dérmica envolvidas na angiogênese e na captação celular. Podem ser utilizados ensaios de feridas (ensaio de risco) ou ensaios de câmara de Boyden (câmara de Boyden), onde as células são expostas ao ingrediente cosmético e sua capacidade de migração é quantificada.

Ensaios de Formação de Tubo Capilar: 

Estes ensaios avaliam a capacidade do ingrediente cosmético em estimular a formação de capilares pelas células endoteliais. Ensaios de gel de matriz (por exemplo, Matrigel) podem ser usados ​​quando as células são cultivadas sob condições que favorecem a formação de estruturas semelhantes a vasos sanguíneos.

Ensaio de Expressão Gênica e Proteica: 

Esses ensaios avaliam alterações na expressão de genes e proteínas relacionadas à angiogênese, proteína B-catenina e captação celular em resposta ao ingrediente cosmético. Técnicas como RT-PCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real) podem ser utilizadas para análise da expressão gênica e Western blotting ou ensaios de imunofluorescência para análise da expressão proteica.

Ensaios de sinalização celular: 

Esses ensaios avaliam a ativação de vias de sinalização específicas, como a via da proteína B-catenina, em resposta ao ingrediente cosmético. Podem ser utilizadas técnicas como ensaios de repórter luciferase, nos quais a atividade de promotores específicos é avaliada em resposta ao ingrediente cosmético.

Os mecanismos fisiológicos de crescimento do cabelo são robustos e os ingredientes cosméticos podem desempenhar um papel significativo na sua promoção. Utilizar metodologias e técnicas precisas, conforme apresentadas acima, para validar essa eficácia é fundamental.

Abordagem de corte

A Crop Biolabs é uma instalação externa integrada de P&D, especializada em uma variedade de serviços pré-clínicos e analíticos, avaliação externa de qualidade e ensaios fenotípicos e moleculares para ingredientes cosméticos, produtos terapêuticos baseados em células, produtos farmacêuticos e empresas de sanitização, além de fornecer fundamentação de reivindicações e avaliações de segurança desde a descoberta até a regulamentação para novas soluções e produtos sob medida.

Nossa missão é colaborar com o amadurecimento tecnológico de produtos e desenvolvimentos em ciências da vida, seja com um atendimento pontual ou com uma solução completa de P&D: da ideia ao impacto.

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Este artigo examinará os principais mecanismos fisiológicos implicados nos processos de lipogênese e adipogênese. Adicionalmente, serão explorados os mecanismos de ação e metodologias de validação de ingredientes cosméticos que inibam efetivamente ambos os processos, facilitando assim a redução da gordura localizada.

Mecanismos Fisiológicos da Lipogênese

A lipogênese é o processo pelo qual ácidos graxos e triglicerídeos, que são moléculas de gordura, são sintetizados a partir de fontes de energia em excesso, como carboidratos e proteínas. Ocorre principalmente no fígado, mas também em outros tecidos, como tecido adiposo, músculos e glândulas mamárias. A lipogênese é regulada por uma variedade de enzimas e fatores de transcrição que governam a expressão gênica e as vias metabólicas envolvidas na síntese de gordura.

Os principais mecanismos de ação subjacentes à lipogênese abrangem:

Absorção de glicose

A glicose é transportada para dentro das células através de transportadores de glicose (GLUTs) e sofre conversão em gliceraldeído-3-fosfato, um intermediário crítico no processo de síntese de ácidos graxos.

Glicolise 

A glicose sofre glicólise, uma via metabólica que ocorre no citoplasma da célula, resultando na conversão da glicose em piruvato. Posteriormente, o piruvato é posteriormente transformado em acetil-CoA, que é transportado para a mitocôndria.

Conversão de acetil-CoA em citrato

Dentro das mitocôndrias, o acetil-CoA derivado da glicólise sofre conversão em citrato catalisado pela enzima citrato sintase.

Transporte de citrato para o citosol

O citrato formado nas mitocôndrias é transportado para o citosol por meio de um transportador específico.

Síntese de ácidos graxos

No citosol, o citrato é convertido novamente em acetil-CoA e malonil-CoA, que são os blocos de construção para a síntese de ácidos graxos. Esses ácidos graxos são então combinados com uma molécula de glicerol para formar triglicerídeos.

Mecanismos Fisiológicos da Adipogênese

A adipogênese é caracterizada como o processo de diferenciação de células-tronco mesenquimais em adipócitos, que são células especializadas no armazenamento de gordura. A adipogênese ocorre principalmente no tecido adiposo, embora também possa ocorrer em menor extensão em outros tecidos. É regulado por uma complexa rede de fatores de transcrição e sinais hormonais.

Os principais mecanismos de ação da adipogênese envolvem:

Proliferação e diferenciação de células-tronco 

As células-tronco mesenquimais presentes no tecido adiposo se multiplicam e se diferenciam em adipócitos imaturos, conhecidos como pré-adipócitos.

Acúmulo de gordura

Os pré-adipócitos acumulam lipídios e aumentam de tamanho, formando gotículas de gordura no citoplasma.

Maturação dos adipócitos 

Os pré-adipócitos passam por um processo de maturação, no qual ocorrem alterações morfológicas e bioquímicas que levam à formação de adipócitos maduros.

Secreção de Adipocinas

Os adipócitos maduros secretam uma série de substâncias bioativas, conhecidas como adipocinas, que desempenham um papel importante na regulação metabólica, inflamação e sinalização hormonal.

Ambos os processos, lipogênese e adipogênese, desempenham papéis essenciais no metabolismo energético e no armazenamento de gordura no corpo.

Os ingredientes cosméticos podem atuar inibindo a lipogênese e a adipogênese, contribuindo para a redução da gordura localizada. A seguir apresentaremos mais detalhes sobre seus mecanismos de ação e técnicas de validação da eficácia de ingredientes cosméticos contra a lipogênese e a adipogênese, a fim de promover esta afirmação.

Mecanismos de ação de ingredientes cosméticos

Ingredientes cosméticos eficazes contra a adipogênese e a lipogênese podem atuar através de diferentes mecanismos.

Aqui estão alguns dos principais:

Inibição de enzimas lipogênicas: 

Alguns ingredientes podem inibir enzimas envolvidas na síntese de ácidos graxos e triglicerídeos, reduzindo assim a lipogênese. Essas enzimas incluem acetil-CoA carboxilase e a enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase. Ao inibir estas enzimas, os ingredientes podem ajudar a reduzir a produção e armazenamento de gordura. Exemplos de ingredientes com esta propriedade incluem extratos de plantas como chá verde, algas e café verde.

Estimulação da lipólise: 

A lipólise é o processo de decomposição dos triglicerídeos em ácidos graxos livres e glicerol. Ingredientes cosméticos podem estimular a lipólise, promovendo assim a liberação de gordura armazenada nas células adiposas. Isto pode ser conseguido através da ativação de enzimas como a lipase sensível a hormônios (HSL). A cafeína é um exemplo de ingrediente que pode estimular a lipólise.

Modulação da diferenciação de adipócitos: 

Alguns ingredientes podem influenciar a diferenciação das células estaminais em adipócitos, controlando assim a formação de novas células adiposas. Isto pode ser conseguido através da regulação de fatores de transcrição e vias de sinalização envolvidas no processo de adipogênese. O ácido retinóico (derivado da vitamina A) é um exemplo de ingrediente que pode modular a diferenciação dos adipócitos.

Aumento da termogênese: 

A termogênese é o processo pelo qual o corpo gera calor e queima calorias. Ingredientes que promovem a termogênese podem aumentar o gasto energético e, portanto, ajudar a reduzir a gordura corporal. A capsaicina, encontrada no pimentão vermelho, é um exemplo de ingrediente que pode aumentar a termogênese.

Metodologias de validação de eficácia de ingredientes cosméticos

Existem diversas metodologias e técnicas in vitro utilizadas para validar a eficácia de ingredientes cosméticos contra a adipogênese e a lipogênese. Estes ensaios fornecem uma avaliação precisa do potencial dos ingredientes para modular estes processos metabólicos.

Aqui estão algumas das técnicas comumente empregadas:

Diferenciação de células pré-adipócitos: 

Neste ensaio, as células pré-adipócitos são cultivadas e induzidas a se diferenciarem em adipócitos maduros. Ingredientes cosméticos são adicionados durante o processo de diferenciação para avaliar seu efeito na formação de adipócitos. O número de adipócitos formados pode ser determinado por diferentes marcadores, como a quantificação de triglicerídeos intracelulares.

Acúmulo lipídico intracelular: 

Nesta abordagem, células pré-adipócitos ou adipócitos já diferenciados são expostos a ingredientes cosméticos, e o acúmulo intracelular de lipídios é avaliado. Corantes lipofílicos, como Oil Red O, são frequentemente usados ​​para rotular e quantificar lipídios acumulados em adipócitos.

Atividade enzimática lipogênica: 

Esses ensaios medem a atividade de enzimas envolvidas na síntese de ácidos graxos e triglicerídeos, como acetil-CoA carboxilase e glicerol-3-fosfato desidrogenase. Ingredientes cosméticos são testados para verificar se são capazes de inibir a atividade dessas enzimas.

Liberação de ácidos graxos: 

Este teste avalia se os ingredientes cosméticos estimulam a lipólise, ou seja, a liberação de ácidos graxos dos adipócitos. Os adipócitos são tratados com os ingredientes e a quantidade de ácidos graxos liberados no meio de cultura é quantificada por métodos bioquímicos ou kits específicos.

Expressão genetica: 

A análise da expressão gênica pode ser realizada usando técnicas como RT-qPCR ou microarranjos de DNA. Estes ensaios permitem avaliar como os ingredientes cosméticos influenciam a expressão de genes envolvidos na adipogênese e na lipogênese. A expressão dos genes ATGL, HSL e PRDM é comumente avaliada por sua relação direta com os mecanismos de lipogênese, conforme descrito abaixo:

• Genes ATGL (lipase triglicerídeo adiposo): 

O gene ATGL codifica a enzima lipase sensível a hormônio conhecida como ATGL. Esta enzima desempenha um papel fundamental na quebra dos triglicerídeos (lipólise) armazenados nas células de gordura. A análise da expressão do gene ATGL permite avaliar os níveis de produção desta enzima e sua influência na lipólise.

• Genes HSL (lipase sensível a hormônios): 

O gene HSL codifica outra enzima chamada lipase sensível a hormônios (HSL). Esta enzima também está envolvida na lipólise e é responsável pela degradação dos triglicerídeos em ácidos graxos livres e glicerol. A análise da expressão do gene HSL é relevante para a compreensão da capacidade das células adiposas de liberar gordura durante o processo de lipólise.

• Genes PRDM (contendo domínio regulador positivo): 

Os genes PRDM pertencem a uma família de genes que codificam fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão gênica. Esses genes podem estar envolvidos em processos metabólicos, incluindo a lipogênese (formação de gordura). A análise da expressão do gene PRDM pode fornecer informações sobre a atividade da lipogênese nas células adiposas.

A técnica RT-qPCR (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real) é amplamente utilizada para medir a quantidade relativa de mRNA específico desses genes em uma amostra de células ou tecidos. A técnica envolve a conversão reversa de mRNA em cDNA (DNA complementar) usando a enzima transcriptase reversa. Em seguida, é realizada PCR em tempo real para amplificar e quantificar o cDNA, permitindo a detecção da expressão dos genes de interesse.

Ao avaliar a eficácia de um ingrediente cosmético contra a lipogênese, a análise da expressão dos genes ATGL, HSL e PRDM por RT-qPCR permite observar alterações nos níveis de mRNA desses genes em resposta ao tratamento com o ingrediente. Se a expressão desses genes for reduzida, pode indicar redução da lipogênese e, portanto, sugerir que o ingrediente cosmético é eficaz na inibição desse processo.

Os mecanismos fisiológicos de adipogênese e lipogênese são robustos e os ingredientes cosméticos podem desempenhar um papel significativo na sua inibição e subsequente redução de gordura localizada. A utilização de metodologias e técnicas precisas, como as apresentadas acima, é essencial para validar a sua eficácia.

Abordagem de corte

A Crop Biolabs é uma instalação externa integrada de P&D, especializada em uma variedade de serviços pré-clínicos e analíticos, avaliação externa de qualidade e ensaios fenotípicos e moleculares para ingredientes cosméticos, produtos terapêuticos baseados em células, produtos farmacêuticos e empresas de sanitização, além de fornecer fundamentação de reivindicações e avaliações de segurança desde a descoberta até a regulamentação para novas soluções e produtos sob medida.

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Esta mudança é evidenciada por um aumento notável de 229% nas pesquisas por ingredientes em 2022, conforme relatou o CEO da THG Beauty. Os consumidores não procuram mais “Channel” ou “L’Oréal” no Google, na verdade procuram “Retinol” ou “vitamina C” 

À medida que os consumidores se tornam cada vez mais conscientes das suas escolhas, as marcas adaptam-se para satisfazer as suas exigências, investindo em investigação e desenvolvimento para criar produtos inovadores que priorizem o poder dos ingredientes.

Este artigo explora a tendência crescente dos consumidores de priorizarem os ingredientes em detrimento das marcas, o impacto na indústria e os desafios enfrentados pelas marcas para atender a esta crescente prioridade do consumidor.

O poder dos ingredientes

Já se foi o tempo em que os consumidores avaliavam um produto cosmético apenas com base nos seus efeitos superficiais. Hoje, eles buscam uma compreensão mais profunda dos ingredientes que compõem seus produtos de beleza e cuidados com a pele.

Esta mudança no comportamento do consumidor levou a um desenvolvimento estimulante: cosméticos que confundem as fronteiras entre maquiagem e cuidados com a pele.

Marcas como Chanel e Victoria Beckham Beauty lançaram produtos que não apenas melhoram a aparência, mas também proporcionam benefícios para a pele.

O bálsamo multiuso para lábios e bochechas da Chanel, enriquecido com camélia vermelha rica em antioxidantes, não apenas proporciona cores vibrantes, mas também auxilia nas funções de barreira da pele.

O Satin Kajal Liner da Victoria Beckham Beauty, enriquecido com extrato de camomila, vitamina E e pantenol, ganhou popularidade por suas propriedades calmantes e hidratantes.

Estes exemplos ilustram como as marcas estão a aproveitar o potencial dos ingredientes para criar produtos que oferecem benefícios multifacetados.

Ingredientes em vez de marcas

Uma tendência notável emergente na indústria da beleza é a crescente ênfase nos ingredientes em detrimento do reconhecimento da marca.

Os consumidores estão investindo tempo e esforço na pesquisa e compreensão dos ingredientes específicos utilizados em seus produtos favoritos.

Esta mudança pode ser atribuída à crescente consciência dos riscos potenciais associados a certos ingredientes, como parabenos, sulfatos, ftalatos e fragrâncias sintéticas.

À medida que a informação se torna mais acessível através das redes sociais e das comunidades de beleza online, os consumidores têm o poder de tomar decisões informadas com base em bases de dados de ingredientes, opiniões de especialistas e análises de pares.

A ascensão do movimento de beleza limpa, com foco em ingredientes naturais, orgânicos e não tóxicos, alimentou ainda mais a priorização de ingredientes.

Os consumidores procuram agora produtos que se alinhem com os seus valores de sustentabilidade, transparência e saúde geral.

Desafios em Pesquisa e Desenvolvimento

Atender às demandas dos consumidores preocupados com os ingredientes apresenta desafios para as marcas em pesquisa e desenvolvimento (P&D). O desenvolvimento de produtos com eficácia comprovada requer tempo e recursos, pois são necessários testes extensivos.

Avaliações e insights fragmentados complicam ainda mais o processo, tornando crucial que as marcas invistam em protocolos de testes abrangentes e completos. Além disso, a compreensão limitada do modo de ação de certos ingredientes representa um obstáculo, à medida que as marcas se esforçam para desenvolver formulações inovadoras que proporcionem benefícios tangíveis. Finalmente, o apoio de marketing torna-se essencial para comunicar os argumentos de venda exclusivos e a diferenciação competitiva de produtos focados em ingredientes.

A indústria da beleza está a testemunhar uma mudança notável nas prioridades dos consumidores, com os ingredientes no centro das atenções. O aumento nas pesquisas por ingredientes reflete um desejo crescente dos consumidores por transparência, segurança e personalização nas suas rotinas de beleza e cuidados com a pele.

As marcas estão à altura do desafio, investindo em I&D para criar produtos que aproveitem o poder dos ingredientes e, ao mesmo tempo, proporcionem os efeitos cosméticos desejados. Ao compreender e atender às necessidades crescentes dos consumidores preocupados com os ingredientes, as marcas podem abrir caminho para o sucesso num mercado cada vez mais competitivo.

Sobre o corte

A Crop Biolabs é uma instalação externa integrada de P&D, especializada em uma variedade de serviços pré-clínicos e analíticos, avaliação externa de qualidade, ensaios fenotípicos e moleculares para ingredientes cosméticos, terapias avançadas, produtos farmacêuticos e empresas de sanitização, além de fornecer fundamentação de reivindicações e avaliações de segurança de da descoberta à regulamentação para novas soluções e produtos sob medida.

Nossa missão é colaborar com o amadurecimento tecnológico de produtos e desenvolvimentos em ciências da vida, seja com um atendimento pontual ou com uma solução completa de P&D: da ideia ao impacto.

Saiba mais sobre a Crop Labs e entre em contato. Vamos trabalhar juntos: https://crop-labs.com

Ciclo de vida do vírus

Para entender como inibir a ação viral, você deve primeiro entendê-la. Antes de abordar os mecanismos e o desenvolvimento das moléculas antivirais, vamos relembrar os principais aspectos do ciclo de vida viral.

Os vírus são parasitas intracelulares que em seu ciclo de vida devem penetrar nas células-alvo do hospedeiro e assumir o controle de sua maquinaria celular. O ciclo de vida viral é composto por três fases distintas, incluindo entrada, replicação do genoma e saída, conforme mostrado na figura a seguir.

Cada uma dessas fases pode ser inibida pela ação de moléculas antivirais e é isso que discutiremos a seguir.

Mecanismos antivirais:

Para compreender a eficácia das moléculas antivirais, é crucial conhecer a fundo os mecanismos pelos quais elas atuam.

As moléculas antivirais podem ter diferentes alvos dentro do ciclo de vida viral, incluindo a inibição da entrada do vírus na célula hospedeira, bloqueando a replicação viral, inibindo a montagem viral ou interrompendo a liberação de partículas virais. Além disso, algumas moléculas antivirais estimulam o sistema imunológico do hospedeiro, fortalecendo a sua resposta antiviral natural.

1. Inibição da entrada viral:

Muitos vírus dependem de interações específicas entre proteínas virais e receptores nas células hospedeiras para entrar e infectar o organismo. Moléculas antivirais podem atuar inibindo essas interações. Um exemplo é a enfuvirtida, medicamento utilizado no tratamento do HIV, que impede a fusão do vírus com a membrana celular, bloqueando sua entrada nas células CD4+.

2. Inibição da replicação viral:

A replicação viral é um processo essencial para a disseminação do vírus no organismo hospedeiro. As moléculas antivirais podem atingir etapas importantes desse processo. Os inibidores da polimerase, por exemplo, são utilizados no tratamento de infecções por hepatite C e atuam inibindo a enzima polimerase viral, essencial para a síntese do material genético do vírus. Esta inibição impede a replicação viral e reduz a carga viral no corpo.

3. Inibição da montagem viral:

Após a replicação viral, novas partículas virais são montadas para formar vírions maduros que são liberados das células hospedeiras. Moléculas antivirais podem interferir nesse processo. Por exemplo, os inibidores de protease são amplamente utilizados no tratamento do HIV. Eles bloqueiam a atividade da enzima protease viral, evitando o processamento de proteínas virais e a formação de partículas virais infecciosas.

4. Estimulação da resposta imunológica:

Outro importante mecanismo antiviral é a estimulação da resposta imune do hospedeiro. Algumas moléculas antivirais podem aumentar a atividade do sistema imunológico, fortalecendo a sua resposta antiviral natural. Isto pode envolver a ativação de células imunológicas, como linfócitos T e células natural killer (NK), que desempenham um papel crucial na eliminação de células infectadas por vírus.

É importante ressaltar que esses mecanismos podem variar de acordo com o tipo de vírus e a classe de moléculas antivirais utilizadas.

Desenvolvimento de medicamentos antivirais:

O desenvolvimento de moléculas antivirais envolve uma série de etapas, desde a identificação de alvos virais promissores até a avaliação pré-clínica e clínica de eficácia e segurança. Os avanços nas técnicas de triagem de alto rendimento e na modelagem computacional aceleraram a descoberta de moléculas com atividade antiviral. Além disso, uma compreensão profunda da biologia viral e da interação vírus-hospedeiro tem sido fundamental na identificação de novos alvos terapêuticos.

Papel dos ensaios pré-clínicos no desenvolvimento de medicamentos antivirais:

Os estudos pré-clínicos desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de medicamentos com moléculas antivirais, fornecendo informações essenciais sobre a eficácia e segurança destas substâncias antes de serem testadas em humanos. Estes estudos são realizados em laboratórios e modelos animais para avaliar o potencial terapêutico das moléculas antivirais e estabelecer as bases para ensaios clínicos subsequentes.

Entre as principais contribuições dos estudos pré-clínicos no desenvolvimento de medicamentos com moléculas antivirais estão:

• Avaliação da atividade antiviral:

Estudos pré-clínicos permitem avaliar a atividade antiviral de moléculas contra diferentes tipos de vírus. Os pesquisadores realizam testes in vitro para determinar se as moléculas podem inibir a replicação viral e reduzir a carga viral. Isto fornece evidências precoces da eficácia potencial das moléculas no combate a infecções virais. Algumas das técnicas in vitro que podem ser utilizadas para esta avaliação são:

• Ensaios de citotoxicidade: Esses ensaios são usados ​​para avaliar se as moléculas antivirais têm toxicidade direta para as células hospedeiras. As técnicas incluem ensaios de coloração com corantes vitais, como o ensaio MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) e o ensaio de exclusão do azul de tripano.
• Ensaios de imunofluorescência: Esses ensaios são usados ​​para visualizar a presença de antígenos virais em células infectadas e para avaliar a eficácia de moléculas antivirais na inibição da replicação viral. Anticorpos específicos são usados ​​para identificar a presença de proteínas virais.
• Quantificação da carga viral por PCR em tempo real: Esta técnica permite a quantificação precisa do RNA ou DNA viral presente nas amostras. É utilizado para avaliar a eficácia de moléculas antivirais na redução da carga viral em células infectadas.
• Ensaios de Cultura em Placas: Nestes ensaios, as células infectadas pelo vírus alvo são cultivadas em placas de cultura e é observada a formação de placas virais. A presença de moléculas antivirais é avaliada pela inibição da formação de placas ou pela redução do número de placas formadas.
• Toxicologia e segurança:

Os estudos pré-clínicos também são cruciais para avaliar a toxicidade e segurança das moléculas antivirais, identificar possíveis efeitos adversos das substâncias e fornecer informações fundamentais para estabelecer a dose segura e eficaz do medicamento e identificar quaisquer riscos potenciais à saúde. Algumas das técnicas in vitro que podem ser utilizadas nesta avaliação são:

• Ensaios de toxicidade celular: Esses ensaios são realizados para avaliar os efeitos de moléculas antivirais em células saudáveis. Alguns exemplos de técnicas utilizadas são o ensaio MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio), o ensaio de exclusão do azul de tripano e o ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH).
• Estudos de genotoxicidade: Os testes de genotoxicidade in vitro avaliam se as moléculas antivirais podem danificar o material genético das células. Algumas técnicas comumente usadas são o teste de micronúcleo, o teste de mutação bacteriana (como o teste de Ames) e o teste de reparo de DNA.
• Farmacocinética e biodisponibilidade:

Estudos pré-clínicos também investigam a farmacocinética das moléculas antivirais, ou seja, como o medicamento é absorvido, distribuído, metabolizado e excretado pelo organismo. Esta informação é importante para determinar a dosagem adequada e a frequência de administração do medicamento. Além disso, estudos pré-clínicos ajudam a identificar a biodisponibilidade das moléculas, ou seja, a quantidade do medicamento que chega efetivamente ao local de ação no organismo.

Dentre as técnicas in vitro que podem ser utilizadas para avaliar a farmacocinética e a biodisponibilidade de medicamentos estão:

• Estudos de absorção celular: Estes estudos utilizam células cultivadas para avaliar a absorção de moléculas antivirais. São realizados ensaios de permeabilidade celular e transporte ativo ou passivo de substâncias.
• Metabolismo hepático in vitro : Células hepáticas isoladas ou linhas celulares específicas são usadas para avaliar o metabolismo hepático de moléculas antivirais. Ensaios como o Ensaio de Microssoma Hepático e o Ensaio de Suspensão de Hepatócitos são comumente usados.

• Ligação às proteínas plasmáticas: Esta técnica avalia a afinidade das moléculas antivirais pelas proteínas plasmáticas, como a albumina. Ensaios de ligação a proteínas in vitro são realizados para determinar a porcentagem de moléculas que se ligam às proteínas.
• Seleção de candidatos para ensaios clínicos:

Com base nos resultados dos estudos pré-clínicos, os investigadores podem selecionar as moléculas antivirais mais promissoras para avançar para os ensaios clínicos em humanos. Os estudos pré-clínicos fornecem dados cruciais que ajudam a informar a escolha dos candidatos mais adequados para a próxima fase de desenvolvimento, tendo em conta tanto a eficácia como a segurança dos medicamentos.

Algumas das técnicas in vitro que contribuem para esta seleção são:

• Ensaios de eficácia antiviral in vitro : Culturas de células infectadas com o vírus alvo são usadas para avaliar a eficácia de moléculas antivirais na inibição da replicação viral. São realizados ensaios de quantificação de carga viral, ensaios de citotoxicidade e ensaios de inibição da expressão gênica viral.
• Ensaios de toxicidade em células não infectadas: Estes ensaios avaliam os efeitos de moléculas antivirais em células saudáveis ​​não infectadas pelo vírus alvo. Ensaios de viabilidade celular, ensaios de estresse oxidativo e ensaios de apoptose são usados ​​para avaliar a toxicidade de substâncias.

É importante ressaltar que as técnicas in vitro podem variar dependendo do vírus alvo, do tipo de célula utilizada e dos objetivos específicos do estudo pré-clínico.

Estudos pré-clínicos são essenciais para o desenvolvimento de medicamentos com moléculas antivirais, fornecendo informações críticas sobre a eficácia antiviral, toxicidade, farmacocinética e segurança dessas substâncias.

Estes estudos são fundamentais para apoiar a tomada de decisão e a seleção dos candidatos mais promissores para ensaios clínicos, aproximando-nos do desenvolvimento de tratamentos antivirais eficazes e seguros.

Exemplos de moléculas antivirais eficazes:

Nos últimos anos, várias moléculas antivirais demonstraram eficácia no tratamento de infecções virais específicas. Um exemplo notável é o uso de inibidores de protease para o tratamento do HIV, que têm sido cruciais na supressão viral e no aumento da sobrevida dos pacientes. Além disso, foram desenvolvidas moléculas antivirais, tais como inibidores da polimerase, para combater infecções por hepatite C, inibindo a replicação viral.

Outro exemplo notável é o desenvolvimento de antivirais de ação ampla, que demonstraram eficácia contra uma variedade de vírus, incluindo o Ébola, o Coronavírus e o Vírus Sincicial Respiratório. Essas moléculas atuam inibindo a replicação viral e têm sido estudadas como potenciais tratamentos para surtos de doenças emergentes.

Desafios e perspectivas:

Embora o progresso na descoberta de moléculas antivirais seja promissor, ainda existem desafios significativos a superar. A resistência viral é uma grande preocupação, pois os vírus podem desenvolver mutações que tornam as moléculas antivirais menos eficazes. Além disso, a toxicidade e os efeitos colaterais dos medicamentos antivirais são questões a serem consideradas durante o desenvolvimento.

No entanto, os avanços na biotecnologia e na terapia genética têm o potencial de impulsionar a descoberta de novas moléculas antivirais e terapias inovadoras. A terapia baseada em RNA, por exemplo, está emergindo como uma abordagem promissora para o tratamento de infecções virais, utilizando moléculas de RNA para silenciar genes virais específicos.

A investigação e o desenvolvimento de moléculas antivirais têm desempenhado um papel crucial no combate às infecções virais. Avanços científicos recentes permitiram a identificação de alvos terapêuticos mais eficazes e o desenvolvimento de medicamentos antivirais que se mostram promissores no tratamento de uma variedade de doenças virais.

Embora subsistam desafios, as perspectivas são encorajadoras, oferecendo esperança para uma melhor prevenção e tratamento de infecções virais no futuro.

Abordagem de corte

A Crop Biolabs é uma instalação externa integrada de P&D, especializada em uma variedade de serviços pré-clínicos e analíticos, avaliação externa de qualidade, ensaios fenotípicos e moleculares para empresas farmacêuticas, terapêuticas avançadas, produtos de saúde, dispositivos médicos, ingredientes cosméticos e sanitizantes, além de fornecer fundamentação de reivindicações e avaliações de segurança desde a descoberta até a regulamentação para novas soluções e produtos sob medida.

Nossa equipe de desenvolvimento de produtos está comprometida em avaliar a qualidade e segurança dos medicamentos e oferece uma variedade de testes pré-clínicos in vitro de acordo com padrões regulatórios nacionais e internacionais.

Saiba mais sobre a Crop Labs e entre em contato. Vamos trabalhar juntos: https://crop-labs.com

Recentemente, a ANVISA divulgou a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 749, que apresenta avanços importantes no processo de obtenção de bioisenção para medicamentos.

Um aspecto chave dessa nova regulamentação é a avaliação de permeabilidade em células Caco-2, uma abordagem alternativa inovadora com benefícios significativos no processo de bioisenção de medicamentos, disposta na Instrução Normativa – IN n° 182.

O que é a bioisenção de medicamentos?

A bioisenção é um processo pelo qual um medicamento similar pode ser considerado terapeuticamente equivalente a um medicamento de referência, sem a necessidade de realizar estudos clínicos de bioequivalência. Isso é possível quando o medicamento genérico/similar demonstra ser absorvido de maneira semelhante ao medicamento de referência, alcançando concentrações no sangue que são bioequivalentes.

Importância e metodologia de avaliação de permeabilidade em células Caco-2:

A nova RDC 749 dinâmica a avaliação de permeabilidade em células Caco-2 como um método alternativo para comprovar a bioisenção de medicamentos. As células Caco-2 são uma linha celular derivada de um carcinoma colorretal humano e são amplamente utilizadas como modelo in vitro para estudar a permeabilidade intestinal.

Essas células são cultivadas em placas de cultura e formam uma monocamada que simula a barreira intestinal. Através da medição da taxa de transporte de uma substância através das células Caco-2, é possível determinar sua permeabilidade intestinal e prever seu comportamento de absorção no trato gastrointestinal.

A avaliação da permeabilidade em células Caco-2 envolve um protocolo com uma série de etapas. Embora os detalhes específicos possam variar dependendo dos requisitos do estudo, a seguir está um passo a passo do modelo da metodologia e avaliação:

1. Cultivo de células Caco-2:
   • Cultivo das células Caco-2 em frascos e meio de cultura adequada, obedecendo às condições de cultivo específicas;
   • Manutenção das células em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono (CO2) e 37°C.
2. Preparação das placas de cultivo de células Caco-2:
   • Preparação das placas de cultura Transwell com membranas permeáveis ​​(geralmente feitas de policarbonato) e tamanho adequado;
   • Imersão das membranas em uma solução de colágeno ou outros revestimentos adequados para melhorar a adesão celular.
3. Semeadura das células Caco-2 nas placas:
   • Remoção do meio de cultura das células Caco-2 e lavagem das células com solução salina tamponada com fosfato (PBS);
   • Despreendimento das células do frasco utilizando uma solução de tripsina e promoção de uma suspensão celular em meio de cultura adequada;
   • Adição das células Caco-2 nas câmaras superiores das placas Transwell, permitindo que as células sejam semeadas nas membranas.
4. Incubação e diferenciação celular:
   • Após a semana, as placas Transwell são incubadas em condições específicas para permitir a diferenciação das células Caco-2;
   • Aplicação do meio de cultura tanto nas câmaras superiores como nas inferiores para criação de um gradiente de concentração que mimetize a fisiologia intestinal.
5. Monitoramento da integridade da monocamada:
   • Verificação da integridade da monocamada celular por meio de espessura da resistência elétrica transepitelial (TEER) utilizando um medidor de resistência adequado;
   • Certificação de que o TEER atingiu um nível estável antes da obrigação com os experimentos.
6. Adição de compostos de teste:
   • Remoção do meio de cultura das câmaras superiores e adição do composto de teste (medicamento ou substância) em concentrações específicas;
   • Incubação das células Caco-2 com os compostos de teste por um período de tempo especificado.
7. Coleta de amostras e análise:
   • Após o período de incubação, coleta das amostras das câmaras inferiores para análise da quantidade do composto teste que atravessou as células Caco-2;
   • Realização da análise através de técnicas como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectrometria de massa ou outros métodos analíticos.
8. Cálculo da permeabilidade:
   • Cálculo da permeabilidade do composto teste utilizando a fórmula, que envolve o cálculo da taxa de transporte através das células Caco-2, a área da membrana e o tempo de incubação.

É importante ressaltar que este é um protocolo básico e que pode haver variações nos detalhes e nas condições experimentais dependendo do objetivo específico do estudo.

Benefícios da avaliação de permeabilidade em células Caco-2:

• Redução de estudos clínicos: 

A utilização da avaliação de permeabilidade em células Caco-2 pode eliminar a necessidade de condução de estudos clínicos de bioequivalência, reduzindo significativamente os custos e o tempo necessário para o fornecimento de bioisenção de medicamentos genéricos.

• Precisão e confiabilidade: 

As células Caco-2 fornecem um modelo relevante e confiável para avaliar a permeabilidade intestinal de medicamentos. Os resultados obtidos através dessa abordagem são altamente preditivos e podem fornecer informações inovadoras sobre a absorção dos medicamentos.

• Redução de testículos em animais: 

A avaliação de permeabilidade em células Caco-2 oferece uma alternativa ética e sustentável aos estudos em animais. Ao substituir os testes tradicionais em animais por testes in vitro, podemos reduzir o uso de animais de laboratório, alinhando-se com os princípios de bem-estar animal.

• Estímulo de pesquisa científica: 

A introdução da avaliação de permeabilidade em células Caco-2 na RDC 749 estimula a pesquisa científica e o desenvolvimento de novas metodologias in vitro. Isso pode levar a avanços avançados na compreensão da tomada de medicamentos e na melhoria dos modelos de previsão de permeabilidade.

A avaliação de permeabilidade em células Caco-2, introduzida pela RDC 749 da ANVISA, representa um marco importante no processo de obtenção de bioisenção de medicamentos. Essa abordagem inovadora traz benefícios, como a redução de estudos clínicos, maior precisão e confiabilidade, redução de testes em animais e estímulo à pesquisa científica.

É fundamental que a indústria farmacêutica e os reguladores trabalhem juntos para implementar essa nova regulamentação e garantir que os medicamentos genéricos disponíveis no mercado sejam de qualidade, seguros e eficazes. A avaliação da permeabilidade em células Caco-2 é uma alternativa segura para contribuir para a inovação e aprimorar a disponibilidade de opções terapêuticas para os pacientes.

Sobre a colheita

A Crop é um laboratório integrado de P&D especializado em serviços pré-clínicos de eficácia e segurança, utilizando metodologias alternativas de cultura celular e biologia molecular para as indústrias de terapêutica avançada, farmacêutica, ingredientes cosméticos e saneantes. 

Nossa missão é colaborar com o amadurecimento tecnológico de produtos e desenvolvimentos em ciências da vida: da ideia ao impacto, levando a ciência da bancada para o mercado e para as pessoas.

Nossa equipe de desenvolvimento de produtos desenvolve uma avaliação de permeabilidade em células Caco-2 para fornecimento de bioequivalência de medicamentos similares de forma ágil e custo-efetiva, confirmados às normativas regulatórias vigentes e ao mercado.

Entre em contato com nossa equipe e saiba como podemos contribuir: https://cropbiolabs.com.br/contact-us/

Referências:

ANVISA. Resolução da Diretoria Colegiada – RDC nº 749 , de 05 de setembro de 2022. Dispõe sobre autorização de estudos de bioequivalência/biodisponibilidade relativa, Diário Oficial da União, 08 de setembro de 2022.

ANVISA. Instrução Normativa – IN n° 182, de 05 de setembro de 2022 . Dispõe sobre a validação e ensaios de permeabilidade com células Caco-2, Diário Oficial da União, 08 de setembro de 2022.

ANVISA. Perguntas e Respostas – RDC nº 749/2022 ; IN nº 182/2022 e IN nº 183/2022, 19 de abril de 2023. Disponível em: https://www.gov.br/anvisa/pt-br/centraisdeconteudo/publicacoes/medicamentos/bioequivalencia/pr-749_2022_ver_01_19_04_2023-1 .pdf

Os produtos de terapia avançada são classificados em três categorias principais: terapia genética, terapia celular e produtos de engenharia de tecidos. Estas abordagens terapêuticas estão em constante desenvolvimento e progresso e, portanto, requerem validações precisas de segurança e eficácia antes da sua aprovação e uso clínico.

Avaliar a qualidade dos produtos de terapia avançada é extremamente importante para garantir a eficácia, segurança e conformidade desses produtos. Esse controle de qualidade e validação pode passar por diferentes metodologias, que devem seguir diretrizes e regulamentações específicas dos órgãos e agências reguladoras correspondentes, como ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), FDA (Food and Drug Administration) e EMA (Agência Europeia de Medicamentos). ), que fornecem orientações detalhadas sobre os requisitos de qualidade para produtos de terapia avançada.

Neste artigo abordaremos as principais estratégias e metodologias de validação e controle de qualidade de produtos de terapia avançada, alinhados às normas regulamentadoras e às tecnologias de ponta produzidas e utilizadas nacional e internacionalmente.

Metodologias de controle de qualidade e validação:

Existem diversas metodologias e técnicas in vitro e moleculares para validação e controle de qualidade de produtos de terapia avançada. A seguir discutiremos os principais: ensaio de diferenciação celular, quantificação de impurezas e metabólitos, detecção de micoplasma, teste de esterilidade, análise de endotoxinas, detecção e quantificação de DMSO, penicilina e estreptomicina, análise de proteínas totais, imunofenotipagem de CTMs, e virologia molecular.

Ensaio de diferenciação celular

O ensaio de diferenciação celular é uma metodologia importante para o controle de qualidade de produtos de terapia avançada, especialmente aqueles que envolvem produtos de terapia celular ou de engenharia de tecidos. Este teste permite avaliar a capacidade das células se diferenciarem em tipos celulares específicos, de acordo com a finalidade terapêutica desejada.

A diferenciação celular refere-se ao processo pelo qual células indiferenciadas se desenvolvem em células especializadas com funções específicas. No contexto dos produtos de terapia avançada, é essencial garantir que as células utilizadas sejam capazes de se diferenciar corretamente em tipos de células relevantes para a terapia em questão. Por exemplo, se as células estaminais mesenquimais forem utilizadas para tratar lesões teciduais, elas devem diferenciar-se em células teciduais alvo, tais como osteócitos, condrócitos ou adipócitos.

O ensaio de diferenciação celular geralmente envolve as seguintes etapas:

1. Cultura de células indiferenciadas: 

As células são cultivadas sob condições específicas que favorecem a manutenção do seu estado indiferenciado, geralmente em meios de cultura específicos e placas de cultura apropriadas.

2. Indução de diferenciação: 

As células são expostas a estímulos específicos ou fatores de crescimento que promovem a diferenciação em tipos celulares desejados. Esses estímulos podem incluir compostos químicos, cocultura com outras células e modificação do ambiente de cultura, entre outros.

3. Avaliação de diferenciação: 

Após um período de exposição a estímulos de diferenciação, as células são analisadas para verificar se adquiriram características morfológicas, marcadores de superfície ou expressão gênica associada ao tipo celular desejado. Isto pode ser conseguido utilizando técnicas como imunofluorescência, citometria de fluxo, reação em cadeia da polimerase (PCR) e análise de expressão gênica.

4. Quantificação da diferenciação: 

Em alguns casos, é necessário quantificar o grau de diferenciação celular. Isto pode ser feito contando células diferenciadas em relação ao número total de células ou empregando ensaios específicos para marcadores de diferenciação.

Através da avaliação e fotodocumentação da diferenciação celular por microscopia invertida é possível identificá-la em três linhagens celulares: osteogênese (coloração com Alizarin Red S), adipogênese (coloração Oil Red) e condrogênese (coloração com azul de toluidina), bem como ilustrado na figura abaixo. A imagem foi tirada por um dos estudos da Crop Biolabs:

Este teste permite avaliar se as células utilizadas no produto de terapia avançada conseguem diferenciar-se adequadamente e, assim, desempenhar a função terapêutica desejada. É fundamental estabelecer critérios de qualidade e especificações pré-definidas para a diferenciação celular, garantindo a consistência e eficácia do produto final.

Quantificação de Impurezas e Metabólitos

Outra metodologia valiosa para validação e controle de qualidade de produtos de terapia avançada é a quantificação de impurezas e metabólitos, que visa identificar e quantificar a presença de impurezas indesejáveis, bem como avaliar a presença de metabólitos que possam afetar a segurança e eficácia. do produto.

Esta metodologia pode ser realizada utilizando diversas técnicas analíticas, dependendo da natureza das impurezas ou metabólitos a serem quantificados, como ensaios enzimáticos ou imunoensaios, cromatografia líquida e espectrometria de massa.

A técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) tem sido amplamente utilizada na avaliação da quantificação de impurezas e metabólitos, pois oferece alta sensibilidade, seletividade e capacidade de identificar compostos presentes em amostras complexas.

A Cromatografia Líquida (LC) é empregada para separar os componentes da amostra com base em suas características químicas, como polaridade, tamanho e afinidade de fase estacionária. Existem diferentes modos de LC que podem ser utilizados, como cromatografia líquida de fase reversa (RP-LC), cromatografia de troca iônica (IC) e cromatografia de exclusão molecular (SEC), entre outros. A escolha do modo LC depende das características dos compostos a serem analisados.

Após a separação cromatográfica, os compostos eluídos são direcionados para Espectrometria de Massas (EM), onde ocorre a ionização dos compostos e sua fragmentação em íons, que posteriormente são detectados. MS permite a identificação de compostos com base em suas massas moleculares e relações massa-carga (m/z). Além disso, a técnica LC-MS permite quantificar os compostos presentes na amostra através da relação entre a intensidade do sinal e a concentração conhecida de um padrão interno ou externo.

No contexto do controle de qualidade de terapias avançadas, a LC-MS pode ser utilizada para quantificar impurezas, como resíduos de reagentes ou produtos de degradação, que possam estar presentes nos produtos. Além disso, a técnica pode ser aplicada para quantificar metabólitos endógenos ou exógenos produzidos por células ou tecidos terapêuticos após administração do produto.

É importante ressaltar que a LC-MS requer preparação adequada da amostra, incluindo extração, purificação e pré-concentração dos compostos de interesse. Além disso, é necessário utilizar padrões de referência para quantificação precisa dos analitos. A validação da metodologia LC-MS é essencial para garantir a robustez, sensibilidade e precisão dos resultados obtidos.

O uso preciso da técnica LC-MS proporciona a detecção e quantificação de lactato, glutamina/glutamato, amônia e glicose em amostras de sobrenadantes de culturas celulares, que são importantes indicadores do metabolismo celular (refletindo a atividade e a saúde das células terapêuticas) e podem estar associado a impurezas e produtos de degradação indesejados em produtos de terapia avançada. Assim, a detecção destes indicadores é importante na avaliação do metabolismo celular e da qualidade do meio de cultura, contribuindo para o controle de qualidade e segurança de terapias avançadas.

Mais detalhes sobre a detecção e quantificação de impurezas e metabólitos podem ser encontrados no Tópico Q3 do Conselho Internacional para Harmonização de Requisitos Técnicos de Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) da EMA.

Detecção de micoplasma

A detecção de micoplasmas também é uma metodologia importante para o controle de qualidade de produtos de terapia avançada. Isto ocorre porque os micoplasmas são organismos microscópicos que podem contaminar culturas celulares e representam uma preocupação significativa no comprometimento da segurança e eficácia dos produtos.

A contaminação por micoplasma pode ocorrer durante o cultivo celular ou através de fontes externas, como reagentes, meio de cultura ou contaminação cruzada. Os micoplasmas podem causar alterações na fisiologia celular, inibindo o crescimento, prejudicando a viabilidade e interferindo nas características funcionais das células terapêuticas.

É importante destacar que a detecção de micoplasmas é uma exigência regulatória para produtos de terapia avançada, sendo exigida pelas agências reguladoras. Além disso, é fundamental a realização regular de testes para detecção de micoplasma durante o desenvolvimento, produção e controle de qualidade de produtos de terapia avançada, garantindo sua segurança e qualidade.

Existem diversas técnicas disponíveis para detecção de micoplasma em produtos de terapia avançada, como cultura em meio seletivo, coloração DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole), Ensaio de Hibridização de Ácido Nucleico e RT-qPCR.

A técnica molecular de RT-qPCR (Reação em cadeia da polimerase em tempo real) é amplamente utilizada para detecção de micoplasma, detectando a presença de gDNA com primers específicos para regiões intergênicas 16S-23S de espécies de Mycoplasma com maior incidência de contaminação de cultura celular ( M. arginina, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale, M. salivarium, M. pirum, A. laylawii). 

Nos “Pontos da FDA a serem considerados na caracterização de linhas celulares usadas para produzir produtos biológicos”. é possível apreciar mais detalhes sobre a detecção de Mycoplasma.

Teste de esterilidade

O teste de esterilidade é outra metodologia fundamental no controle de qualidade de produtos de terapia avançada. Tem como objetivo verificar se um produto está livre de microrganismos viáveis, como bactérias, fungos e vírus, que podem causar infecções ou comprometer a segurança do paciente.

Produtos de terapia avançada, como terapia celular, terapia gênica e produtos de engenharia de tecidos, são produzidos em ambientes complexos e podem estar expostos a riscos de contaminação durante diversas etapas do processo, desde a coleta da matéria-prima até a manipulação em laboratório, dificultando o teste de esterilidade. essencial para garantir a qualidade e segurança destes produtos.

Existem diferentes métodos para realizar o teste de esterilidade, sendo os mais comuns:

• Método de filtro de membrana: 

Neste método, uma amostra do produto é filtrada através de uma membrana com poros de tamanho definido, geralmente 0,45 ou 0,2 micrômetros. A membrana retém os microrganismos presentes na amostra, que é posteriormente incubada em meios de cultura apropriados para permitir o crescimento dos microrganismos. A ausência de crescimento após o período de incubação indica que o produto é estéril.

• Método de Inoculação Direta: 

Neste método, uma quantidade específica do produto é transferida para um meio de cultura estéril e apropriado. O meio de cultura é incubado e observado quanto ao crescimento de microrganismos ao longo do tempo. A ausência de crescimento após a incubação indica a esterilidade do produto.

A detecção de bactérias anaeróbias e aeróbias, leveduras e fungos é frequentemente realizada por inóculo de amostras em caldo de tioglicolato e caseína de soja no teste de esterilidade para controle de qualidade de terapias avançadas. Isso porque esses meios de cultura favorecem o crescimento de diversos tipos de microrganismos e aumentam a sensibilidade do teste de esterilidade.

O Caldo Tioglicolato é um meio de cultura enriquecido que fornece condições adequadas para o crescimento de uma ampla variedade de microrganismos, incluindo bactérias anaeróbias e aeróbicas. Este meio contém nutrientes que apoiam o crescimento tanto de microrganismos que necessitam de oxigênio quanto daqueles que crescem melhor na ausência de oxigênio. Portanto, o inóculo de amostras em caldo de tioglicolato permite a detecção de bactérias aeróbias e anaeróbias presentes em produtos de terapia avançada.

A caseína de soja é outro meio de cultura utilizado para testes de esterilidade. Este meio é rico em nutrientes e permite o crescimento de bactérias, leveduras e fungos. O inóculo das amostras em caseína de soja permite detectar a contaminação por estes microrganismos.

No teste de esterilidade, amostras de produtos de terapia avançada são inoculadas em frascos contendo caldo de tioglicolato e caseína de soja. Os frascos são incubados em condições adequadas, como temperatura e atmosfera controladas, por um tempo especificado. Após a incubação, os frascos são observados quanto ao crescimento microbiano, tal como turvação ou formação de colónias visíveis.

A detecção de crescimento microbiano no meio de cultura indica que o produto não está estéril, indicando a presença de contaminação. Embora a ausência de crescimento microbiano e sua esterilidade.

É importante observar que os requisitos regulamentares e as diretrizes para estes procedimentos podem variar entre os diferentes produtos de terapia avançada. Além disso, a validação destes métodos é essencial para garantir a sua eficácia e fiabilidade.

A detecção de bactérias anaeróbias e aeróbias, leveduras e fungos através do inóculo de amostras em caldo de tioglicolato e caseína de soja no teste de esterilidade é uma abordagem amplamente utilizada e reconhecida para o controle de qualidade de terapias avançadas e permite identificar contaminações microbianas que podem comprometer a segurança e eficácia dos produtos.

A realização regular de testes de esterilidade em produtos de terapia avançada garante que os produtos estejam livres de microrganismos viáveis, reduzindo o risco de infecção e garantindo a segurança do paciente. É uma etapa crucial no controle de qualidade para garantir que os produtos atendam aos padrões exigidos pelas autoridades reguladoras e pelas boas práticas de fabricação.

Análise de endotoxina

A análise de endotoxinas é outra metodologia vital para o controle de qualidade de produtos de terapia avançada. Por serem componentes bacterianos lipopolissacarídeos (LPS) presentes nas paredes celulares de bactérias Gram-negativas, a presença de endotoxinas em produtos terapêuticos pode representar um risco significativo à segurança do paciente, pois têm potencial para desencadear reações inflamatórias e imunológicas adversas.

A análise de endotoxinas é geralmente realizada usando o método Gel Clot Limulus amebócitos lisado (LAL), que se baseia na capacidade das endotoxinas de ativar a cascata de coagulação do lisado de amebócitos Limulus (LAL). LAL é um reagente derivado do sangue do caranguejo-ferradura (Limulus polyphemus), que contém amebócitos (células sanguíneas) sensíveis a endotoxinas. Quando as endotoxinas estão presentes, ocorre a coagulação do LAL, que pode ser quantificada e utilizada para determinar a quantidade de endotoxinas presentes na amostra.

A análise de endotoxinas é especialmente relevante para produtos de terapia avançada que envolvem materiais biológicos, como culturas celulares, meios de cultura, soluções de armazenamento e dispositivos médicos. Estes materiais podem ser fontes potenciais de contaminação bacteriana e, portanto, podem conter endotoxinas.

Os limites permitidos de endotoxinas em produtos de terapia avançada são definidos por agências reguladoras e, portanto, devem ser testados quanto à presença de endotoxinas de acordo com requisitos regulamentares específicos.

É importante mencionar que a análise de endotoxinas deve ser realizada por métodos e padrões pouco reconhecidos, como o capítulo <85> da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) e o capítulo 2.6.14 da Farmacopeia Europeia (EP). Além disso, é necessário garantir a validação do método, incluindo a verificação da sensibilidade e especificidade do teste.

Detecção e quantificação de dimetilsulfóxido (DMSO)

A detecção e quantificação do dimetilsulfóxido (DMSO) pode fazer parte do controle de qualidade de produtos terapêuticos, principalmente daqueles que utilizam o DMSO como componente importante no processo de fabricação ou preservação.

DMSO é um solvente amplamente utilizado em pesquisas biológicas e terapias avançadas. Pode ser utilizado como crioprotetor, auxiliando na preservação de células e tecidos durante o processo de congelamento e armazenamento a longo prazo. No entanto, é importante garantir que os produtos finais não exagerem com níveis excessivos de DMSO, pois concentrações elevadas podem ter efeitos tóxicos nas células e tecidos.

A detecção e quantificação do DMSO pode ser realizada através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada à espectrometria de massa (MS), permitindo a separação e identificação do DMSO na amostra, bem como a quantificação precisa de sua concentração.

No processo de controle de qualidade, amostras de produtos são preparadas e analisadas seguindo requisitos e diretrizes regulatórias aplicáveis, estabelecendo limites aceitáveis ​​para concentração de DMSO com base em estudos de segurança e eficácia. Amostras do produto testado são comparadas com esses limites de segurança para garantir a conformidade.

Ao manter as concentrações de DMSO dentro dos limites estabelecidos, é possível minimizar seus efeitos tóxicos e preservar a viabilidade e funcionalidade de células e tecidos utilizados em terapias avançadas, tornando o ensaio de detecção e quantificação de DMSO uma parte essencial do controle de qualidade do produto que o utiliza.

É importante ressaltar que a metodologia exata para detectar e quantificar o DMSO pode variar dependendo dos requisitos específicos do produto e das diretrizes regulatórias aplicáveis. Portanto, é fundamental seguir práticas adequadas e métodos validados para garantir resultados confiáveis ​​e precisos.

Detecção de penicilina e estreptomicina

Assim como o ensaio de detecção e quantificação de DMSO, o teste de detecção de penicilina e estreptomicina torna-se parte essencial do controle de qualidade dos produtos de terapia avançada que os utilizam durante seu processo de fabricação ou caso haja possibilidade de contaminação cruzada com essas substâncias.

A penicilina e a estreptomicina são antibióticos amplamente utilizados no tratamento de infecções bacterianas. Contudo, em certos casos, a presença destes antibióticos em produtos terapêuticos pode ser indesejável.

Para a detecção de penicilina e estreptomicina, a técnica mais utilizada também é a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS), que permite o processo de separação e identificação dos antibióticos na amostra, bem como a quantificação precisa de suas concentrações .

Análise de proteína total (BCA)

A análise de proteínas totais pelo método BCA (bicinchoninato de cobre) pode ser uma metodologia importante para o controle de qualidade de produtos de terapia avançada. A quantificação de proteínas totais é relevante, pois fornece informações sobre a concentração de proteínas presentes no produto, o que é importante para garantir a consistência e qualidade do produto final.

O método BCA é uma técnica colorimétrica baseada na reação entre a proteína presente na amostra e o reagente BCA. O reagente forma um complexo colorido com as proteínas em solução, e a intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de proteínas presentes. Essa intensidade pode ser medida utilizando técnicas como Western-Blot para quantificar a concentração de proteínas na amostra.

A análise da proteína total utilizando o método BCA pode ser realizada em vários estágios do processo de fabricação do produto de terapia avançada. Por exemplo, é comum realizar esta análise para verificar a concentração de proteínas em meios de cultura, soluções de armazenamento e produtos derivados de células ou tecidos, entre outros.

Ao realizar a análise de proteínas totais, é importante seguir os procedimentos adequados e estabelecer um protocolo validado. Isto envolve a preparação correta da amostra, a adição do reagente BCA e uma leitura espectrofotométrica precisa para quantificar a concentração de proteína. Além disso, é importante utilizar um padrão de proteína de referência para calibrar a curva de calibração e garantir resultados confiáveis ​​e comparáveis.

Imunofenotipagem de células-tronco mesenquimais

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células multipotentes capazes de se diferenciar em diversos tipos celulares, sendo amplamente utilizadas em pesquisas e aplicações terapêuticas devido às suas propriedades regenerativas e imunomoduladoras.

A imunofenotipagem de MSC é um processo que envolve a marcação e detecção de antígenos específicos na superfície das MSC usando anticorpos monoclonais. Estes anticorpos podem ser conjugados com marcadores fluorescentes ou enzimáticos para permitir a identificação e caracterização de MSCs. Através da imunofenotipagem é possível avaliar a presença ou ausência de marcadores de superfície específicos nas CTMs, o que auxilia na identificação e caracterização dessas células.

No controle de qualidade de terapias avançadas utilizando CTMs, a imunofenotipagem é amplamente utilizada para confirmar a identidade das células e avaliar sua pureza e viabilidade. Isto é especialmente importante porque a presença de outras células contaminantes pode afetar a segurança e eficácia do produto final.

Através da imunofenotipagem é possível identificar marcadores específicos de CTMs, como CD73, CD90 e CD105, e excluir a presença de marcadores celulares indesejáveis, como CD45 (marcador de células do sistema imunológico) e CD34 (marcador de células progenitoras hematopoiéticas). células).

Além disso, a imunofenotipagem também pode ser utilizada para monitorar a qualidade e consistência das CTMs ao longo do tempo, permitindo a avaliação de alterações nas características fenotípicas das células durante a expansão in vitro. Isto é importante para garantir a estabilidade das marcas comunitárias e manter a conformidade com os requisitos de qualidade e eficácia.

A imunofenotipagem de MSCs é realizada por citometria de fluxo, técnica que permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros de fluorescência em células individuais. Os resultados da imunofenotipagem são interpretados comparando padrões de expressão de marcadores em MSCs com controles apropriados e com perfis fenotípicos conhecidos de MSCs, com interpretação de positividade quando ≥ 95% positivo para CD73, CD90 e CD105 e ≤ 2% negativo para CD34, CD45, CD11b ou CD14, CD19 ou CD79α e HLA-DR (Sociedade Internacional de Terapia Celular).

Virologia molecular

A virologia molecular desempenha um papel essencial no controlo de qualidade de terapias avançadas, permitindo a detecção e quantificação de ácidos nucleicos de diferentes vírus presentes em produtos terapêuticos. Para isso, são utilizadas diversas técnicas, como RT-qPCR, TCID50 (dose infecciosa 50%) e título viral infeccioso.

RT-qPCR é uma técnica sensível e específica que permite a detecção e quantificação de ácidos nucleicos virais em amostras. Combina transcrição reversa (RT), que converte o RNA viral em DNA complementar (cDNA), e PCR em tempo real, que amplifica e quantifica o cDNA viral. RT-qPCR é comumente usado para a detecção de vírus como CMV (citomegalovírus), HIV-1 e HIV-2, HTLV-I e HTLV-II, EBV (vírus Epstein-Barr), HBV (vírus da hepatite B), HCV (vírus da hepatite C) e B19 (parvovírus humano B19).

A técnica TCID50 é usada para determinar a concentração de partículas virais infecciosas em uma amostra. TCID50 significa “dose infecciosa de 50%”, que é a diluição da amostra que resulta em 50% de células infectadas. Este método é frequentemente utilizado para avaliar a infecciosidade de vírus em produtos terapêuticos, tais como culturas de células ou preparações virais.

O título viral infeccioso é outra abordagem para quantificar a concentração de partículas virais infecciosas. Este método mede a quantidade de vírus capaz de infectar células-alvo em uma amostra. Geralmente envolve diluição em série da amostra, inoculação em células apropriadas e avaliação do efeito citopático (morte ou alteração celular) após um determinado período de incubação. O título viral infeccioso é particularmente útil para avaliar a presença e atividade de vírus infecciosos em terapias avançadas.

A utilização destas técnicas de virologia molecular, como RT-qPCR, TCID50 e títulos virais infecciosos, no controle de qualidade de terapias avançadas permite a detecção, quantificação e avaliação da atividade viral em produtos terapêuticos. Estas metodologias são essenciais para garantir a segurança do produto e minimizar o risco de transmissão viral aos pacientes.

Abordagem de corte 

A Crop Biolabs é uma instalação externa integrada de P&D, especializada em uma variedade de serviços pré-clínicos e analíticos, avaliação externa de qualidade e ensaios fenotípicos e moleculares para empresas terapêuticas baseadas em células, produtos farmacêuticos, ingredientes cosméticos e sanitizantes, além de fornecer fundamentação de reivindicações e avaliações de segurança desde a descoberta até a regulamentação para novas soluções e produtos sob medida.

Nossa equipe de desenvolvimento de produtos oferece Controle de Qualidade e validação para terapias celulares alinhadas às normas regulatórias da ANVISA, FDA e EMA, e inclui em seu portfólio todas as metodologias apresentadas no artigo (ensaio de diferenciação celular, quantificação de impurezas e metabólitos, detecção de micoplasma, teste de esterilidade, análise de endotoxinas, detecção e quantificação de DMSO, penicilina e estreptomicina, análise de proteínas totais, imunofenotipagem de CTMs e virologia molecular), de forma personalizada, ágil, econômica e humanizada. 

Nossa missão é colaborar com o amadurecimento tecnológico de produtos e desenvolvimentos em ciências da vida, seja com um atendimento pontual ou com uma solução completa de P&D: da ideia ao impacto.

Saiba mais sobre a Crop Labs e entre em contato. Vamos trabalhar juntos: https://crop-labs.com

Referências: 

• Conselho Internacional para Harmonização de Requisitos Técnicos Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) Tópico Q3 , EMA; 
• Pontos da FDA a serem considerados na caracterização de linhas celulares usadas para produzir produtos biológicos;
• Farmacopeia Brasileira, 6ª edição teste de esterilidade (5.5.3.2.1);

• Centro de Avaliação e Pesquisa Biológica da FDA AVANÇO DA CIÊNCIA REGULATÓRIA – Escritório de Tecidos e Terapias Avançadas Divisão de Terapias Celulares e Genéticas Ramo de Terapia Celular e Tecidual;
• Medicamentos à base de células estaminais da EMA – Orientação científica.

Para contribuir com o desenvolvimento de novos produtos científicos, a Crop Biolabs selecionou seis (6) iniciativas, entre novos negócios e startups, empresas globais e Instituições Científicas e de Inovação Tecnológica (ICT) nos segmentos de cosméticos, saneantes, terapias avançadas e produtos para saúde, para receber consultorias regulatórias gratuitas de Pesquisa & Desenvolvimento (P&D) entre março e abril de 2023. 

As consultorias foram conduzidas pelo CEO da Crop Biolabs, Aruã Prudenciatti, e abordaram tópicos fundamentais, desde a ciência de bancada até o mercado. Além disso, foram apresentadas tecnologias ágeis e custo-efetivas de P&D, alinhadas às melhores práticas internacionais.

Dentre os casos de destaque que receberam apoio da Crop Biolabs, está a empresa Tianlong, uma das maiores fabricantes globais de equipamentos e kits para diagnóstico molecular. Recentemente, a Tianlong expandiu suas operações para o Brasil e buscou a consultoria da Crop para validar seus produtos nos mercados agro e humano do país.

Outro caso de destaque foi um novo insumo farmacêutico ativo vegetal (IFAV) desenvolvido por um docente de uma ICT, indicado para o tratamento de dermatite atópica. Com base nesse insumo, foi desenvolvido um novo fitoterápico, que já possui patente concedida. Durante a consultoria, a Crop Biolabs apoiou a avaliação e estratégias de adesão do produto ao mercado, assim como seus aspectos regulatórios.

Sobre a Crop

A Crop é um laboratório integrado de P&D especializado em serviços pré-clínicos de eficácia e segurança, utilizando metodologias alternativas de cultura celular e biologia molecular para as indústrias de terapêutica avançada, farmacêutica, ingredientes cosméticos e saneantes. 

A Crop Labs continua comprometida em impulsionar a inovação científica e apoiar empresas e instituições na jornada do desenvolvimento de produtos.

Saiba mais sobre a Crop Labs e entre em contato. Vamos trabalhar juntos: https://crop-labs.com

A eficácia da hidratação pode ser proporcionada por produtos cosméticos e é um dos principais benefícios buscados pelos consumidores. A sua eficácia depende diretamente dos seus ingredientes, que podem ser validados pela sua ação hidratante através de técnicas de avaliação da expressão genética.

Neste artigo, exploraremos os mecanismos fisiológicos de hidratação e técnicas para validar a eficácia hidratante de ingredientes cosméticos por meio de técnicas de avaliação de expressão gênica de última geração.

Mecanismos Fisiológicos do Hidatrion

A hidratação da pele é composta por diferentes mecanismos fisiológicos interligados, tais como função de barreira, NMFs, produção de sebo e produção de suor:

1. Função de barreira: 

A função de barreira da pele é crucial para manter níveis adequados de hidratação. Esta função é desempenhada principalmente pelo estrato córneo, a camada mais externa da epiderme.

O estrato córneo é composto por células mortas e achatadas chamadas corneócitos, que são cercadas por uma matriz lipídica composta por ceramidas, colesterol e ácidos graxos. Esta matriz lipídica atua como uma barreira para prevenir a perda de água da pele e proteger contra fatores externos como microorganismos e irritantes.

O estrato córneo também contém fatores hidratantes naturais (NMFs), como aminoácidos, uréia e ácido láctico, que ajudam a manter os níveis de hidratação da pele. Esses NMFs atraem água e a retêm na pele, evitando a desidratação.

Além disso, a pele possui uma rede de vasos sanguíneos e nervos que ajudam a regular os níveis de hidratação. Quando a pele fica desidratada, os vasos sanguíneos se contraem, reduzindo o fluxo sanguíneo para a pele e diminuindo a perda de água pela superfície da pele. Os nervos da pele também podem detectar alterações nos níveis de hidratação e desencadear respostas como suor ou sede para manter a hidratação adequada.

2. Fatores Hidratantes Naturais (NMFs): 

Os fatores hidratantes naturais (NMFs) são essenciais para manter os níveis de hidratação da pele. NMFs são um grupo de pequenas moléculas encontradas no estrato córneo e são derivadas de aminoácidos, ácido pirrolidona carboxílico (PCA) e outros compostos.

Os NMFs atuam como um ímã de água, atraindo moléculas de água para a superfície da pele e mantendo-as ali, evitando a perda de água da pele. Também ajudam a regular o teor de água nas células da pele, garantindo que permaneçam hidratadas e funcionando adequadamente.

Os NMFs são produzidos pelas células da pele e estão presentes em altas concentrações no estrato córneo. Eles atuam em conjunto com outros componentes da barreira cutânea, como a matriz lipídica, para criar uma barreira protetora que previne a desidratação e protege contra fatores externos como microorganismos e irritantes.

Quando a pele é exposta a fatores ambientais, como temperaturas extremas ou baixa umidade, os NMFs se esgotam, causando ressecamento da pele. Hidratantes tópicos contendo NMFs, como uréia e glicerina, podem ajudar a repor a hidratação natural da pele e melhorar sua capacidade de reter a umidade.

3. Produção de sebo: 

O sebo é uma substância oleosa produzida pelas glândulas sebáceas localizadas na camada dérmica da pele. A produção de sebo desempenha um papel importante na manutenção dos níveis de hidratação da pele, embora os seus efeitos na hidratação da pele possam variar dependendo da quantidade de sebo produzida e de outros factores.

A principal função do sebo é hidratar e proteger a pele. O sebo é composto por triglicerídeos, ácidos graxos e outros lipídios que criam uma barreira natural na superfície da pele, evitando a perda de água e protegendo contra fatores externos como bactérias e irritantes.

A produção de sebo é regulada por um sistema complexo de hormônios, incluindo andrógenos como a testosterona, que estimulam as glândulas sebáceas a produzirem sebo. A quantidade de sebo produzida pode variar dependendo de fatores como idade, sexo e genética, bem como de fatores ambientais como umidade e temperatura.

Quando a pele produz uma quantidade adequada de sebo, pode ajudar a manter os níveis adequados de hidratação e prevenir a desidratação. No entanto, a produção excessiva de sebo pode causar pele oleosa e poros obstruídos, enquanto a produção insuficiente de sebo pode resultar em pele seca.

4. Produção de suor: 

A produção de suor é outro mecanismo fisiológico importante que desempenha um papel na hidratação da pele. O suor é produzido pelas glândulas sudoríparas localizadas na camada dérmica da pele e é composto principalmente de água, eletrólitos e pequenas quantidades de outros compostos, como uréia e ácido láctico.

A produção de suor é regulada pelo sistema nervoso autônomo, que responde às mudanças na temperatura corporal e outros estímulos. Quando o corpo fica superaquecido, as glândulas sudoríparas são estimuladas a produzir suor, que é então liberado na superfície da pele. À medida que o suor evapora, esfria a pele e ajuda a regular a temperatura corporal.

O suor também desempenha um papel na manutenção dos níveis de hidratação da pele, contribuindo para a hidratação natural da pele. O suor contém água e eletrólitos como sódio, cloreto e potássio, que ajudam a hidratar a pele e equilibrar os níveis de pH. Isso pode ajudar a prevenir a desidratação e manter a barreira natural de hidratação da pele.

No entanto, a transpiração excessiva pode levar à desidratação e perda de eletrólitos, o que pode causar ressecamento da pele. Isto é particularmente verdadeiro em ambientes com baixa umidade, pois o suor pode evaporar mais rapidamente e levar ao aumento da perda de água pela pele.

No geral, estes mecanismos fisiológicos trabalham em conjunto para garantir que a pele permaneça adequadamente hidratada. Quando qualquer um desses mecanismos é interrompido, como pela exposição ao ar seco ou a produtos químicos agressivos, a pele pode ficar seca. 

Expressão Gênica da Hidratação

Outro fator fundamental que regula a hidratação da pele é a expressão gênica dos genes AQP3, AQP9 e AQP10 , que codificam proteínas da família das aquaporinas , responsáveis ​​pelo transporte de água pelas membranas celulares , afetando diretamente a manutenção da hidratação da pele. Aqui está uma breve descrição de cada um desses genes e suas funções:

• AQP3: Este gene codifica a aquaporina 3, que é expressa na epiderme e nas glândulas sebáceas da pele. AQP3 é responsável por transportar água e glicerol para as células da pele, o que ajuda a manter a hidratação da pele. Estudos demonstraram que a expressão de AQP3 é reduzida em condições de pele seca ou envelhecida.
• AQP9: Este gene codifica a aquaporina 9, que é expressa em vários tecidos, incluindo a pele. AQP9 é responsável pelo transporte de água e outros solutos, como uréia e glicerol, para as células da pele. Estudos demonstraram que a expressão de AQP9 aumenta em condições de pele seca ou danificada como resultado da resposta inflamatória.
• AQP10: Este gene codifica a aquaporina 10, que é expressa principalmente nas glândulas sudoríparas da pele. AQP10 é responsável pelo transporte de água e íons, como o sódio, para as células da pele. Estudos demonstraram que a expressão de AQP10 é reduzida em condições de pele seca ou danificada.

Juntos, os genes AQP3, AQP9 e AQP10 desempenham um papel importante na manutenção da hidratação da pele , transportando água e outros solutos para as células da pele. A expressão reduzida destes genes pode contribuir para a pele seca, enquanto a expressão aumentada pode ser uma resposta adaptativa à pele danificada ou seca.

Assim, avaliar a expressão gênica dos genes AQP3, AQP9 e AQP10 é uma estratégia valiosa para validar a eficácia da hidratação de ingredientes cosméticos, visto que eles estão envolvidos na regulação da hidratação da pele e que sua expressão pode ser afetada por compostos e ingredientes que promovem ou mantêm a hidratação da pele.

Validando a eficácia da hidratação por técnicas de expressão gênica

Técnicas de expressão gênica podem ser usadas para validar a eficácia de hidratação de ingredientes cosméticos ou outros produtos destinados a melhorar a hidratação da pele, como reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR), análise de microarranjos e sequenciamento de RNA. Neste artigo focaremos no RT-qPCR para avaliar os genes AQP3, AQP9 e AQP10 , relacionados à hidratação da pele. 

Para usar RT-qPCR para avaliar a expressão gênica, primeiro o RNA deve ser extraído do tecido da pele. Isto pode ser feito utilizando kits comerciais que utilizam métodos químicos ou físicos para isolar o RNA total. Em seguida, o cDNA (DNA complementar) é sintetizado a partir do RNA usando transcrição reversa . O cDNA resultante pode ser usado como modelo para RT-qPCR.

O RT-qPCR utiliza sondas fluorescentes para quantificar a quantidade de cDNA presente na amostra. O sinal fluorescente gerado durante a amplificação é medido em tempo real , permitindo a quantificação dos níveis de expressão genética . Os níveis de expressão dos genes alvo, AQP3, AQP9 e AQP10, podem ser normalizados para os níveis de expressão dos genes de referência para levar em conta variações na qualidade e quantidade do RNA.

Ao comparar os níveis de expressão de AQP3, AQP9 e AQP10 antes e depois do tratamento com uma intervenção de hidratação, como um ingrediente cosmético, é possível avaliar a eficácia de hidratação da intervenção. Se os níveis de expressão destes genes aumentarem após o tratamento, isso sugere que a intervenção melhorou a hidratação da pele, aumentando a expressão de aquaporinas envolvidas no transporte de água através da barreira cutânea.

No geral, o RT-qPCR é uma ferramenta poderosa para avaliar os níveis de expressão de genes relacionados à hidratação da pele e pode ser usado para validar a eficácia das intervenções de hidratação. Ao fornecer uma compreensão a nível molecular das alterações na expressão genética, esta técnica pode ajudar a identificar alvos potenciais para intervenção e orientar o desenvolvimento de estratégias de hidratação mais eficazes.

Abordagem de corte 

A Crop Biolabs é uma instalação externa integrada de P&D, especializada em uma variedade de serviços pré-clínicos e analíticos, avaliação externa de qualidade, ensaios fenotípicos e moleculares para empresas terapêuticas avançadas, farmacêuticas, ingredientes cosméticos e sanitizantes, além de fornecer fundamentação de reivindicações e avaliações de segurança de da descoberta à regulamentação para novas soluções e produtos sob medida.

Nossa equipe de desenvolvimento de produtos valida a eficácia da hidratação de ingredientes cosméticos avaliando a expressão dos genes AQP3, AQP9 e AQP10 pela técnica RT-qPCR com um plano de trabalho personalizado, ágil e econômico.

Nossa missão é colaborar com o amadurecimento tecnológico de produtos e desenvolvimentos em ciências da vida, seja com um atendimento pontual ou com uma solução completa de P&D: da ideia ao impacto.

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